Reakcja łańcuchowa polimerazy: 9 ważnych wyjaśnień

by

Spis treści

Co to jest reakcja łańcuchowa polimerazy?

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest kolejnym szeroko stosowanym Biologia molekularna technika enzymatycznego wytwarzania DNA bez wykorzystania mechanizmów komórkowych, na przykład drożdże lub E. coli. Metoda zezwala na ograniczoną ilość plików DNA być wzmacniany kilka fałd dramatycznie. PCR jest regularnie używany w kliniczny, sądowyi laboratoria biologiczne do różnych celów, takich jak określanie genetyczne odciski palców, diagnoza choroby, klonowanie genów, i testy na ojcostwo. 

Ta technika została stworzona w 1983 roku przez Kary Mullis. PCR jest obecnie kluczową i znaczącą procedurą wykorzystywaną w biologii stosowanej. Te zawierają Klonowanie DNA do sekwencjonowania, filogenezy opartej na DNA lub aktywnego badania ekspresji genów i określania chorób przenoszonych genetycznie. W 1993 roku Mullis otrzymał nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za pracę nad PCR. 

PCR jest zwykle przeprowadzany w mieszaninie reakcyjnej o całkowitej objętości 0.1-0.2 ml w probówkach reakcyjnych (objętości 0.2-0.5 ml) w urządzeniu znanym jako termocykler. Termocykler podgrzewa i chłodzi DNA, aby osiągnąć temperatury wymagane na każdym etapie reakcji. Cienkościenne rury reakcyjne zapewniają pożądaną przewodność cieplną, umożliwiając szybsze wyrównanie termiczne. Zwykle termocyklery mają podgrzewane szczyty lub pokrywki, które zapobiegają kondensacji składników reakcji na górze probówki. 

Reakcja łańcuchowa polimerazy
Rys.: Termocykler
https://www.flickr.com/photos/45141485@N04/6358197387/

Wymagania dotyczące reakcji łańcuchowej polimerazy

  • DNA fragment do amplifikacji (matryca DNA lub cDNA)
  • Primers (starter prawy i starter odwrotny) zdolny do rozpoznawania końców matrycowego DNA. Startery mają zwykle długość 18-25 par zasad.
  • Termostabilny Polimeraza DNA (Polimeraza Taq) katalizuje syntezę DNA. Polimeraza Taq jest otrzymywana z Termus wodny.
  • Nukleotydy
  • Bufor (zapewnia optymalne podłoże dla aktywności termostabilnej polimerazy DNA)
DNA
Rysunek: DNA jest amplifikowane przez PCR
https://www.flickr.com/photos/hinkelstone/33255693331/

Zasada działania reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR nazywa się reakcją łańcuchową, ponieważ nowo zsyntetyzowane nici będą działać jako matryca do dalszej syntezy DNA w kolejnych cyklach. 

PCR składa się z 3 następujących po sobie reakcji:

  • Denaturacja DNA: Proces denaturacji oddziela nici dwuniciowego DNA. W przypadku ludzkiego DNA temperatura denaturacji wynosi około 93-95oC. Denaturacja DNA odbywa się poprzez zerwanie wiązań wodorowych między dwiema nićmi polinukleotydowymi DNA. Proces denaturacji jest często przeprowadzany przez 5 minut lub przez dłuższy czas, aby zapewnić, że obie nici matrycowego DNA są w pełni oddzielone od siebie. Proces denaturacji aktywuje również termostabilną polimerazę DNA.
  • Wyżarzanie podkładu: Po denaturacji do mieszaniny reakcyjnej wprowadza się startery lewy i prawy. Roztwór jest następnie schładzany do wyżarzania podkładu. Zwykle wyżarzanie podkładu następuje między 50-70oC w zależności od Tm (temperatury topnienia) DNA. Idealnie temperatura wyżarzania wynosi 5oC poniżej Tm. Temperatura hybrydyzacji powinna być niska, aby utworzyć hybrydę między starterem a matrycowym DNA i wystarczająco wysoka, aby zapobiec niedopasowaniu hybryd. Tm DNA zależy wyłącznie od zawartości GC i AT w DNA. Etap wyżarzania podkładu trwa zwykle 1-2 minuty. Tm można wyznaczyć eksperymentalnie lub wyliczyć teoretycznie według poniższego wzoru:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • Synteza DNA: termostabilna polimeraza DNA (polimeraza Taq) wiąże się w pobliżu region wiążący RNA i zawiera wolne nukleotydy do wydłużania i syntezy nowej nici DNA sąsiadującej z nicią matrycową. Optymalna temperatura etapu wydłużania zależy od rodzaju użytej polimerazy; dla polimerazy Taq optymalna temperatura wynosi około 72oC. Czas trwania tego etapu wydłużania zależy od długości matrycowego DNA i wydajności termostabilnej polimerazy DNA; zwykle jest to jedna kilopar zasad na minutę.

Wszystkie wspomniane powyżej reakcje są powtarzane 30 razy, aby uzyskać około 1 miliarda kopii matrycowego DNA.

Aktualizacja PCR WP 3
Rysunek: Schematyczne przedstawienie amplifikacji DNA metodą łańcuchowej reakcji polimerazy
https://www.flickr.com/photos/genomegov/26454931973/

Etapy łańcuchowej reakcji polimerazy

Proces PCR dzieli się na trzy etapy:

  • Wzmocnienie wykładnicze: Polimeraza DNA spełnia optymalną funkcję, a po zakończeniu każdego cyklu ilość produktu ulega podwojeniu. Jedynie niewielka ilość DNA musi być obecna w punkcie początkowym reakcji, ponieważ reakcja jest bardzo wrażliwa.
  • Etap wyrównywania: Polimeraza DNA wykazuje mniejszą aktywność z powodu mniejszej dostępności odczynników, takich jak nukleotydy.
  • Taca: produkt nie tworzy się już z powodu wyczerpania odczynnika.

Zastosowania reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR można wykorzystać do identyfikacji licznych nieprawidłowości związanych z genomem, szerokiego zakresu analiz i eksperymentów. Kilka przykładów zastosowania PCR omówiono poniżej:

  • Identyfikacja w próbce czynników zakaźnych, takich jak CMV, mykoplazma, zapalenie płuc, choroby zakaźne i związane z pierwotniakami, zapalenie wątroby itp.
  • Określenie złośliwości, szczególnie w przypadku chłoniaka i białaczki. 
  • Testy na ojcostwo i genetyczne odciski palców. 

PCR pozwala na wczesną identyfikację nieprawidłowości, które są obecnie najbardziej rozwinięte w badaniach nad rakiem. Pomiary PCR można wykonać bezpośrednio na próbkach genomowego DNA, aby rozpoznać komórki nowotworowe specyficzne dla translokacji z czułością ponad 10,000 XNUMX razy większą niż jakąkolwiek inną metodą. 

PCR identyfikuje również nieulegające hodowli i wolno rosnące mikroorganizmy, takie jak prątki, mikroorganizmy beztlenowe i wirusy, na podstawie technik hodowli tkankowej i modeli zwierzęcych. Przykładowe zastosowania PCR w mikrobiologii to rozpoznawanie patogenów i ich zdolność rozróżniać szczepy niepatogenne od szczepów chorobotwórczych poprzez identyfikację określonych genów. 

PCR służy do zintensyfikowania krótkiego fragmentu nici DNA. Ta nić DNA może być kompletnym genem lub tylko częścią genu. W przeciwieństwie do żywych systemów, cykl PCR może amplifikować tylko krótkie fragmenty DNA do 10 par zasad. Różne inne techniki mogą amplifikować fragmenty DNA o wielkości do 40 kb, czyli wciąż mniejszej niż rozmiar chromosomalny DNA eukariota komórka – na przykład komórka ludzka zawiera około trzech miliardów par zasad nukleotydowych. 

Testy ojcowskie można przeprowadzić za pomocą PCR, pobierając DNA osób będących w sporze. DNA badanych osobników jest amplifikowane i trawione Enzymy restrykcyjne i analizowane za pomocą elektroforezy żelowej. Wzór fragmentów DNA na żelu agrozowym jest znany jako odcisk palca DNA osobnika. Osoby bliskie lub spokrewnione będą miały podobne Odciski palców DNA w porównaniu do daleko spokrewnionych lub niespokrewnionych osób. Uzyskane odciski palców mogą być dalej analizowane pod kątem rodzic-dziecko lub rodzeństwa z dwoma lub więcej genetycznymi (DNA) odciskami palców. The Uzyskane odciski DNA można wykorzystać do poznania ewolucyjne relacje między organizmami. 

Jego rozmiar pozwala łatwo rozpoznać końcowy produkt reakcji PCR elektroforeza w żelu agarozowym. Elektroforezę w żelu agarozowym przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie próbek DNA do żelu agarozowego. Prąd elektryczny przepływa przez żel agarozowy, aby poznać ruchliwość próbek DNA. Mniejsze fragmenty DNA poruszają się szybciej w żelu i odwrotnie. Produkt PCR i fragment DNA próbki identyfikuje się przez wprowadzenie drabinki DNA do żelu agarozowego. Drabina DNA zawiera cząsteczki DNA o znanej wielkości. 

Wcześniej identyfikacja zaburzenia genetycznego poprzez obserwację genomu była trudną pracą. Później, dzięki rozwojowi PCR, proces ten zostaje skrócony. Każdy interesujący gen może być łatwo amplifikowany przy użyciu odpowiednich starterów, a następnie sekwencjonowany w celu wykrycia mutacji w DNA. Wczesną identyfikację niektórych śmiertelnych infekcji wirusowych można również przeprowadzić za pomocą PCR. 

Palec DNA
Rysunek: Odciski palców DNA są używane do testów na ojcostwo
https://www.flickr.com/photos/nasamarshall/33350284091/

Rodzaje reakcji łańcuchowej polimerazy

W oparciu o odpowiednie modyfikacje techniki, Łańcuchowa reakcja polimerazy dzieli się na następujące typy:

  • Zagnieżdżona PCR
  • Odwrotna PCR
  • Odwrotna transkrypcja (RT-PCR)
  • Asymetryczna PCR
  • Ilościowe (PCR-Q-PCR)
  • Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (QRT-PCR)
  • PCR przy przyziemieniu
  • PCR kolonii
  • PCR specyficzna dla alleli
  • Montaż PCR lub cykliczny montaż polimerazy (PCA)
  • Asymetryczna PCR
  • Liniowy po wykładniczym PCR (LATE-PCR)
  • Wydzwaniany PCR
  • Wzmocnienie zależne od helikazy
  • Gorący start PCR
  • PCR specyficzny między sekwencjami
  • Odwrotna PCR
  • PCR za pośrednictwem ligacji
  • PCR specyficzna dla metylacji
  • Mini-starter PCR

Zalety reakcji łańcuchowej polimerazy

  • Reakcja łańcuchowa polimerazy może być stosowana do identyfikacji różnych nieprawidłowości genetycznych.
  • PCR jest stosowany w wielu różnych eksperymentach laboratoryjnych i procedurach biologii molekularnej.
  • PCR może wykryć - nowotwory złośliwe, takie jak białaczka, chłoniak itp. Oraz różne inne stany, takie jak Toxoplasma gondi, bakteriemia gronkowcowa, infekcje malarii itp.
  • Genetyczne odciski palców i testy na ojcostwo obejmują PCR jako kluczowy krok.
  • Wysoka czułość i specyficzność PCR sprawia, że ​​jest to ważne narzędzie w eksperymentach opartych na biotechnologii i biologii molekularnej.

Wady reakcji łańcuchowej polimerazy

  • Reakcja łańcuchowa polimerazy wymaga termocyklera, montażu elektroforetycznego DNA, zestawu do izolacji DNA i innych kosztownych chemikaliów, które powodują, że proces jest drogi.
  • Wymaga przeszkolonych, wykwalifikowanych i doświadczonych techników do przeprowadzania eksperymentów.
  • Wymagane są laboratoria na podstawowym poziomie bezpieczeństwa z odwilżaczami i urządzeniami z przepływem laminarnym.
  • Trudno jest pozwolić zwykłym ludziom na testy oparte na PCR.
  • Nie wszystkie choroby można było zidentyfikować i zdiagnozować za pomocą PCR.
  • Możliwość uzyskania wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych.

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest powszechnie stosowaną i powszechnie akceptowaną techniką identyfikacji kilku śmiertelnych czynników zakaźnych z czułością i swoistością. PCR jest stosowany w różnych zaawansowanych ośrodkach medycznych, nowoczesnych laboratoriach i instytutach medycznych jako rutynowy moduł diagnostyczny i badawczy. Reakcja łańcuchowa polimerazy odgrywa kluczową rolę w identyfikacji nieprawidłowości reprezentujących nietypowe objawy kliniczne; PCR umożliwia wczesne wykrycie tego typu upośledzeń. Wczesne wykrywanie może pomóc w zarządzaniu jednostką w dużo lepszy sposób, co może zmniejszyć społeczne i ekonomiczne obciążenie rodziny badanego.

Aby dowiedzieć się więcej na inne tematy dotyczące biosyntezy i biotechnologii kliknij tutaj

Pytania wielokrotne sprawdzania koncepcji

Pytanie nr. 1: Student przeprowadza PCR w celu amplifikacji próbki matrycowego DNA. Ale zapomniał dodać startera DNA w eksperymencie. Która z poniższych opcji daje najlepszy możliwy wynik?

Odp .: Reakcja nie nastąpi.

B- Reakcja będzie działać, ale proces będzie wzmacniał niespecyficzne regiony (a nie pożądaną część DNA DNA.

C- Reakcja będzie działać, ale w dłuższym tempie

D- Reakcja zadziała, a produkt będzie wykazywał niepożądane mutacje.

Opcja: Prawidłowa odpowiedź to „reakcja nie nastąpi”.

Wyjaśnienie: Startery są niezbędne do funkcjonowania PCR. Polimeraza Taq potrzebuje ich do wiązania (na etapie przyłączania) do zainicjowania replikacja DNA. Zatem reakcja PCR nie będzie działać przy braku starterów i nie nastąpi amplifikacja.

Pytanie nr. 2: Student / badacz chce wstawić ludzki gen hemoglobiny do wektora ekspresyjnego w celu sklonowania i ekspresji tego genu w komórkach myszy w celu przeanalizowania powstałego fenotypu. Która z poniższych procedur pozwoli studentowi / badaczowi na pomyślne sklonowanie genu?

Opcja:

1. Wzmocnij gen za pomocą PCR

2. Użyć enzymu restrykcyjnego do cięcia wektora ekspresyjnego

3. Gen ligacji i strawiony wektor

Opcja B: 

1. Gen ligacji

2. Użyć enzymu restrykcyjnego do cięcia wektora ekspresyjnego 

3. Powiel gen i strawiony wektor ekspresyjny za pomocą PCR

Opcja C:

1. Użyć enzymu restrykcyjnego do cięcia wektora ekspresyjnego

2. Wzmocnij gen za pomocą PCR

3. Gen ligacji i strawiony wektor

Opcja D:

1. Użyć enzymu restrykcyjnego do cięcia wektora ekspresyjnego

2. Gen ligacji i strawiony wektor

3. Amplifikować gen za pomocą PCR

Opcja: Jest skorygowania opcja 

1. Wzmocnij gen za pomocą PCR

2. Użyć enzymu restrykcyjnego do cięcia wektora ekspresyjnego

3. Gen ligacji i strawiony wektor

Wyjaśnienie: Po pierwsze, użyjemy PCR do amplifikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania z ludzkiego genomu posiadającego miejsca restrykcyjne na końcach (pomoże to w jego ligacji do restrykcji trawiony enzymami wektor). Później wektor ekspresyjny musi być trawiony przy użyciu tego samego enzymu restrykcyjnego, a następnie trawiony wektor i amplifikowany gen zligowano razem. Produkt końcowy będzie składał się z dwóch segmentów: oryginalnego wektora i genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Pytanie nr. 3: Który instrument jest używany do zakończenia amplifikacji DNA za pomocą PCR?

A- Analizator genetyczny

B- Spektrofotometr UV

C- termocykler

D- Wirówka

Opcja C: Thermocycler to poprawna odpowiedź

Wyjaśnienie: Termocykler można ustawić tak, aby obsługiwał cykl etapów denaturacji, wyżarzania i wydłużania, odpowiednio, w niewielkiej ilości objętości reakcyjnej. Do przeprowadzenia amplifikacji PCR stosuje się termocykler.

Aby uzyskać więcej postów na temat zaawansowanej nauki, śledź pod tym linkiem.

Przeczytaj także: