Mikroskopia fluorescencyjna: 5 ważnych faktów, które powinieneś wiedzieć

Spis treści

Co to jest mikroskopia fluorescencyjna?

Mikroskopy fluorescencyjne to rodzaj mikroskopu złożonego, który współpracuje z kilkoma wariantami źródeł światła o różnych zakresach długości fali do fluorescencji próbki w celu uzyskania obrazów zastępujących transmisję, absorpcję, odbicie i rozpraszanie. Te mikroskopijne warianty są używane głównie do obserwacji próbek biologicznych. Mikroskopię fluorescencyjną można uzyskać, stosując prostą konstrukcję mikroskopu epifluorescencyjnego lub złożonego mikroskopu konfokalnego.

Jak działa mikroskopia fluorescencyjna?

Próbka jest najpierw trzymana na stoliku mikroskopowym. Próbka jest następnie oświetlana w zależności od potrzebnej ilości światła. W mikroskopii fluorescencyjnej do oświetlania próbki stosuje się światło o różnych długościach fal, które jest następnie absorbowane przez fluorofory obecny w próbce, który dodatkowo emituje wiązkę światła o dłuższych długościach fal lub o innym kolorze niż światło wpadające. Filtr emisji widmowej służy do oddzielania słabszego emitowanego światła od silniejszego światła świecącego. Ogólny mikroskop fluorescencyjny składa się z następujących części.

1. Filtr wzbudzenia.
2. Lustro dichroiczne lub rozdzielacz wiązki.
3. Filtr emisyjny.
4. Źródło światła (może to być ksenonowa lampa łukowa, lampa rtęciowa, diody LED dużej mocy lub lasery).
5. Zestaw obiektywów.
6. Soczewka okularowa.
7. Stolik do przechowywania próbki.
8. Detektor.

Rozdzielacz wiązki dichroicznej oraz filtry wzbudzenia i emisji są dobrane tak, aby wzbudzenie widmowe było zgodne z charakterystyką emisji, fluoroforu używanego do znakowania próbek i tak wykrywa się w tym czasie rozkład pojedynczego koloru lub fluoroforu . Aby obserwować obrazy wielokolorowe, należy połączyć kilka obrazów jednokolorowych. Niektóre konstrukcje mikroskopowe są wyposażone w CCD (urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym) w tubusie mikroskopu zamiast soczewki okularu. W mikroskopie z zainstalowanym przetwornikiem CCD obraz powstaje na ekranie monitora po umieszczeniu matrycy CCD na pośredniej płaszczyźnie obrazu.

Co to jest mikroskopia epifluorescencyjna?

W mikroskopii Epi-fluorescencyjnej wzbudzenie próbki fluorescencją i wykrywanie emitowanego światła fluorescencyjnego odbywa się poprzez podążanie tą samą drogą światła, tj. Przez soczewkę obiektywu. Takie mikroskopy są specjalnie używane do obserwacji żywych próbek. Aby uzyskać większą rozdzielczość obrazów, należy zwiększyć aperturę numeryczną obiektywu. Fluorescencja Epi wytwarza wysoki stosunek sygnału do szumu, ponieważ pewna ilość odbitego światła świetlnego łączy się ze światłem emitowanym przez próbkę. Z tego powodu zastosowano dichroiczny rozdzielacz wiązki. Ten rozdzielacz wiązki działa jako selektywny filtr długości fali i przepuszcza tylko emitowane światło fluorescencyjne do okularu lub soczewki oka.

Jakie są wady mikroskopii fluorescencyjnej?

1. Wraz z czasem naświetlania fluoroforów w wyniku procesu fotowybielania, fluorofory mogą utracić swoją zdolność do fluorescencji. Fotowybielanie ma miejsce, gdy cząsteczki fluorescencyjne stopniowo ulegają uszkodzeniom chemicznym w wyniku wzbudzenia elektronów podczas fluorescencji. Fotowybielanie może poważnie wpłynąć na czas obserwacji próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
2. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwiła badanie żywych komórek. Jednak te żywe komórki są podatne na fototoksyczność (głównie w przypadku światła o krótkiej długości fali), a cząsteczka fluorescencyjna może wytwarzać specyficzne czynniki reaktywne po oświetleniu, co dodatkowo zwiększa efekt fototoksyczny.
3. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia obrazowanie i obserwację tylko niektórych struktur, które zostały oznaczone jako fluorescencyjne. tj. próbkę tkanki można obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli próbki są przedstawiane z fluorescencyjnym wybarwieniem DNA. Może to pokazać organizację DNA w komórkach, ale nie jest w stanie ujawnić niczego na temat morfologii komórki.

Jak przygotowywana jest próbka fluorescencyjna?

Wiemy, że mikroskopia fluorescencyjna umożliwia obrazowanie i obserwację tylko niektórych struktur, które zostały oznaczone jako fluorescencyjne. Dlatego obserwowana próbka jest fluorescencyjna za pomocą różnych technik, takich jak:

1. Biologiczne barwniki fluorescencyjne: Wykonuje się kilka rodzajów barwników fluorescencyjnych, które są kompatybilne z szeregiem próbek biologicznych. Niektóre przykłady takich barwników fluorescencyjnych to DRAQ7 i DRAQ5 (wzbudzane czerwonym światłem), Hoechst i DAPI (wzbudzane światłem ultrafioletowym), falloidyna, Peptyd hybrydyzujący kolagen itp.
2. Immunofluorescencja: Immunofluorescencja służy do wiązania przeciwciała.
3. Fluorescencyjne białka: Białka fluorescencyjne są używane do modyfikowania DNA tak, aby cząsteczki wykazywały fluorescencję.

Aby dowiedzieć się więcej o wizycie w mikroskopie złożonym https://techiescience.com/compound-microscope-working-5-important-uses/

Przeczytaj także:

• Mikroskopia sondy skanującej
• Szczegółowy przegląd tunelu aerodynamicznego
• Jak powstaje cień?
• Izoterma adsorpcji
• Egzosfera 2
• Co to jest chwytak pneumatyczny
• Dlaczego tłumienie krytyczne jest szybsze niż nadmierne
• Odwrotnie proporcjonalny
• Reguła ilorazu
• Osmoza a dyfuzja