Różne typy PCR: ważne konceptualne MCQ

by

Spis treści

Różne typy PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest ogólnie klasyfikowany na podstawie niewielkich modyfikacji w standardowym procesie PCR. Różne typy PCR są następujące:

Zagnieżdżona PCR

Zaproponowano tę technikę w celu zmniejszenia zanieczyszczeń w amplifikowanym DNA z powodu amplifikacji losowego wiązania startera. Nested PCR jest przeprowadzany z dwoma różnymi zestawami starterów w dwóch kolejnych cyklach PCR. Oczekuje się, że kolejny zestaw wzmocni drugorzędny cel w produkcie pierwszego przebiegu. Ta technika jest wyjątkowo skuteczna, chociaż wymaga znacznie większej wiedzy na temat zaangażowanych sekwencji. 

Odwrotna PCR

Jest wykonywany, gdy znana jest tylko pojedyncza wewnętrzna sekwencja matrycowego DNA. Technika ta jest odpowiednia do identyfikacji sekwencji flankujących do różnych wstawek genów. Proces obejmuje sekwencję trawienia i samoligacji matrycowego DNA, co skutkuje fragmentami DNA ze znanymi sekwencjami na końcach nieznanej sekwencji.

Różne typy PCR
(Różne typy PCR): Przedstawienie struktury molekularnej polimerazy Taq https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

Służy do amplifikacji i identyfikacji znanych sekwencji z bibliotek RNA. RNA otrzymane z próbki jest następnie przekształcane w komplementarny DNA (cDNA) pod działaniem enzymu odwrotnej transkryptazy enzymu. Później przeprowadzono typowy PCR. RT-PCR jest szeroko stosowany do identyfikacji i określania ekspresji genów.

Różne typy PCR
(Różne typy PCR): RT-PCR wykorzystuje fluorofory do wykrywania poziomów ekspresji genów https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

Asymetryczna PCR

Selektywnie wzmacnia jedną nić matrycowego DNA bardziej niż drugą. Jest stosowany w sondowaniu hybrydyzacyjnym, w którym tylko jedna nić jest uważana za idealną. Dalszą amplifikację uzyskuje się przez przeprowadzenie standardowego PCR w obecności nadmiaru starterów dla wybranej nici. 

Ilościowy PCR (Q-PCR)

Jest to pośrednia procedura pomiaru początkowych ilości RNA, cDNA lub matrycowego DNA. Q-PCR jest zwykle używany do szybkiego określenia ilości produktu PCR. Q-PCR jest również używany do wykrywania określonych sekwencji w próbce DNA.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (QRT-PCR lub RTQ-PCR)

Ten proces wykorzystuje barwniki fluorescencyjne do monitorowania i pomiaru w czasie rzeczywistym ilości amplifikowanych produktów. Ten ilościowy PCR w czasie rzeczywistym jest używany w połączeniu z QPCR.

PCR przy przyziemieniu

Technika ta zmniejsza niespecyficzne wiązanie startera poprzez obniżenie temperatury renaturacji między dwoma kolejnymi cyklami PCR.

PCR kolonii

Klony (np. E. coli) analizowano pod kątem właściwych produktów ligacji. Określoną kolonię pobiera się sterylną wykałaczką i wprowadza do mieszanki głównej. PCR działa z wydłużonym czasem 95oC.

PCR specyficzny dla alleli

Technika ta opiera się na polimorfizmie pojedynczego nukleotydu (SNP), a do klonowania i celów diagnostycznych często stosuje się specyficzną dla alleli PCR. Wymagana jest wcześniejsza wiedza na temat sekwencji DNA alleli i różnic między nimi. PCR specyficzny dla alleli obejmuje zastosowanie starterów SNP zawierających koniec 3 '. Pomyślna amplifikacja PCR specyficzna dla allelu i startery specyficzne dla SNP wskazują na obecność określonego SNP w sekwencji.

Polymerase Cycling Assembly (PCA) lub Assembly PCR

Obejmuje sztuczne wytwarzanie długich sekwencji DNA w obecności długich oligonukleotydów i krótkich nakładających się segmentów zgodnie ze standardową procedurą PCR. Długie oligonukleotydy odwracają się w obu kierunkach (sensowny i antysensowny), nakładający się segment decyduje o kolejności fragmentów PCR, ułatwiając selektywne wytwarzanie końcowego długiego DNA.

Liniowy po wykładniczym PCR (LATE-PCR)

W tej technice, starter ograniczający (starter obecny w mniejszej ilości) ma wyższą temperaturę topnienia niż nadmiar startera (starter obecny w wystarczającej ilości) dla utrzymania wydajności reakcji, ponieważ stężenie startera ograniczającego zmniejsza się w środku reakcji . 

Wydzwaniane połączenie PCR .

Jest to metoda odzyskiwania cząsteczek DNA do syntezy genów. Biblioteka DNA jest modyfikowana specyficznymi tagami flankującymi przed sekwencjonowaniem. Później, startery ukierunkowane na znacznik pozwalają na odzyskanie DNA o pożądanych sekwencjach przez PCR.

Wzmocnienie zależne od helikazy

Jest to związane z tradycyjnym PCR, ale zamiast cykli wykorzystuje stałą temperaturę. Helikaza DNA jest używana zamiast etapu denaturacji termicznej. 

Gorący start PCR

Ta technika wyklucza możliwość niespecyficznej amplifikacji podczas początkowych cykli PCR. Składniki reakcyjne są podgrzewane w temperaturze denaturującej 95 ° CoC przed dodaniem polimerazy. Inhibitory i przeciwciała są wprowadzane do mieszaniny reakcyjnej w celu zahamowania Polimeraza DNA aktywność, która ulega dysocjacji w wysokich temperaturach. 

Specyficzna międzysekwencyjna PCR

Ta modyfikacja techniki PCR jest często wykorzystywana do pobierania odcisków palców DNA, co wymaga amplifikacji regionów umieszczonych między prostymi powtórzeniami sekwencji, aby wygenerować unikalny i specyficzny odcisk palca / wzór amplifikowanych fragmentów DNA. 

PCR za pośrednictwem ligacji

W szczególności wykorzystuje małe cząsteczki łącznikowe DNA (do wstawienia) i różne startery zdolne do hybrydyzacji z DNA łącznika. Technika ta jest szeroko stosowana do sekwencjonowania DNA i drukowania stóp.

PCR specyficzna dla metylacji

Technika ta jest używana do wykrywania wysp CpG w genomie. W PCR specyficznym dla metylacji DNA jest traktowany wodorosiarczanem sodu, który przekształca niemetylowaną zasadę cytozyny w uracyl, który jest identyfikowany / rozpoznawany przez zasady tyminy startera PCR. Na zmienionym DNA przeprowadza się dwa różne zestawy PCR przy użyciu identycznych zestawów starterów, z wyjątkiem wysp CpG starterów. Zestawy starterów rozpoznają zasady cytozyny, a inne zestawy starterów rozpoznają uracyl w celu amplifikacji niemetylowanego DNA. Q-PCR można również przeprowadzić, aby poznać informacje ilościowe dotyczące metylacji. 

Koncepcyjne pytania wielokanałowe dotyczące różnych typów reakcji PCR (rozwiązane)

Pytanie 1: Badacz próbuje zmienić pięć kolejnych par zasad w środku fragmentów DNA amplifikowanych metodą PCR. Która technika jest najbardziej zalecana do przeprowadzenia takiego eksperymentu?

A- ligacja DNA

B- Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)

C- mutageneza PCR

D- Enzym restrykcyjny trawienie

Poprawna odpowiedź: Opcja C Mutageneza PCR 

Wyjaśnienie:

Najbardziej zalecaną techniką tego typu modyfikacji jest mutageneza PCR. Może syntetyzować startery, które wiążą się niedoskonale w pożądanym miejscu mutagenezy. Te startery będą teraz zawierały nową sekwencję 5-par zasad, która ma zostać wprowadzona do nowej nici DNA. Po pierwsze, PCR wzmocni fragment DNA zawierający zmutowaną sekwencję i sekwencje poprzedzające. Drugi cykl PCR będzie amplifikował nową nić DNA zawierającą zmutowaną sekwencję, a także kolejne sekwencje. Ostatni cykl PCR będzie amplifikował jeden fragment DNA z dwóch matryc, używając oryginalnych starterów do amplifikacji pełnej długości nici DNA.

Pytanie 2: Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) wykorzystuje termostabilną polimerazę (polimerazę Taq) do amplifikacji nici DNA. Które ze stwierdzeń najlepiej opisuje, dlaczego termostabilne polimerazy są wymagane do PCR?

A-PCR wymaga cykli termicznych, a polimerazy Taq można dezaktywować, ponieważ nie są potrzebne podczas etapów niskotemperaturowych. 

B- Termostabilna polimeraza (Taq) nie rozbija dsDNA, chyba że temperatura jest bardzo wysoka. Dlatego wymagana jest polimeraza termostabilna (Taq).

C- PCR wymaga cykli termicznych, a termostabilne (Taq) polimerazy nie będą denaturować, aby stracić skuteczność w polimeryzacji DNA w wysokiej temperaturze (95oC) krok. 

D- Oddziaływanie między dwuwartościowymi kationami i polimerazą DNA jest bardzo wydajne podczas etapów wysokotemperaturowych. Zatem PCR wymaga termostabilnej polimerazy DNA.

E- polimerazy termostabilne (Taq) są tańsze niż standardowe polimerazy; w ten sposób są bardziej odpowiednie do amplifikacji DNA. 

Prawidłowa odpowiedź: opcja C

PCR wymaga cykli termicznych, a termostabilne (Taq) polimerazy nie ulegną denaturacji, aby stracić skuteczność w polimeryzacji DNA w wysokiej temperaturze (95oC) krok. To sprawia, że ​​jest wyjątkowy wśród różnych typów PCR.

Wyjaśnienie:

Polimerazy często denaturują w wyższych temperaturach. Gdyby zastosowano standardową polimerazę, uległaby ona denaturacji podczas etapu wysokiej temperatury (denaturacji), który jest potrzebny do rozbicia dwuniciowego DNA na jednoniciowe matryce DNA. Stosując tę ​​termostabilną polimerazę (Taq), enzym nie ulega denaturacji. Nici DNA będą kontynuowały amplifikację przez polimerazę Taq dodaną na początku reakcji PCR.

Pytanie 3: Jaka jest prawidłowa kolejność trzech etapów PCR?

A- Wydłużanie, denaturacja, wyżarzanie

B- Denaturacja, wyżarzanie, wydłużanie 

C- Wyżarzanie, przedłużanie, denaturacja

D- Denaturacja, wydłużanie, wyżarzanie

Prawidłowa odpowiedź: opcja B.

Denaturacja, wyżarzanie, wydłużanie 

Wyjaśnienie:

Etapy PCR obejmują denaturację, przyłączanie i wydłużanie.

Denaturację przeprowadza się w temperaturze około 94-98 ° C w celu zerwania wiązań wodorowych dwuniciowego DNA. 

Wyżarzanie jest drugim etapem PCR zakończonym w temperaturze 50-65 ° C. Etap hybrydyzacji musi być przeprowadzony w niskiej temperaturze w celu przyłączenia starterów do pojedynczej nici, ale wystarczająco wysokiej, aby uniknąć niespecyficznej hybrydyzacji. 

Etap wydłużania lub wydłużania PCR umożliwia polimerazie DNA syntezę ostatniej kopii matrycy nici DNA. Optymalna temperatura zależy od zastosowanej polimerazy DNA, ale zwykle waha się w granicach 75-80 ° C.

Pytanie 4: Który z poniższych jest / nie jest składnikiem mieszaniny reakcyjnej polimerazy?

A- Roztwór buforowy

Polimeraza B-DNA

C- Formamid

Nić matrycowa D-DNA

Prawidłowa odpowiedź: opcja C

Formamid

Wyjaśnienie:

Składnikami PCR są polimeraza DNA (Taq), bufor, startery, chlorek magnezu, dNTP (adenina, guanina, cytozyna, tymina), trifosforany deoksynukleotydów oraz nić matrycowa DNA.

wnioski

W tym artykule omówiliśmy różne typy PCR. Więcej informacji na ten temat znajdziesz na stronie różne typy PCR.

Więcej tematów na biosynteza i biotechnologia możesz odwiedzić nasze strony.

Przeczytaj także: